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图像法粒度粒形分析仪可用于区分癌细胞和正常细胞?

发布时间:2019-08-05 阅读:1604

    从正常血细胞中检测异常细胞(如癌细胞) 对肿瘤的诊断和治疗具有重要意义。传统检测癌细胞的方法通常是冗长繁琐的。本文中,我们将使用粒径分析仪进行癌细胞与正常细胞的粒径分化。使用粒径分析仪测量的结果显示,肿瘤细胞的尺寸参数(如内径和宽度)明显大于正常细胞(白细胞(WBC)、淋巴球、淋巴细胞),但其形状参数(如圆度和凸度)并没有明显差异。与正常细胞相比,大部分癌细胞的内径大于10μm。为了检测与癌细胞具有相似大小的WBC,我们开发出基于细胞表面固定点的亮度来区分癌细胞的软件—“癌细胞探测器”。此外,上述方法通过检测小鼠血液样本(B16黑色素瘤小鼠异种移植)中的癌细胞/簇模型),以及猫和狗(诊断为癌症)的循环肿瘤细胞簇样颗粒血液样本进行了验证。这些结果充分显示使用粒径分析仪并配合相应的软件,在实验和临床中对癌细胞的检测具有重要的意义。
    异常细胞从原始细胞中偏离可能是身体患病的征兆,因此,它们的检测和识别非常重要。典型的病例就是不可控的细胞分裂和异常细胞的生长有可能是癌症。有些癌细胞,比如循环肿瘤细胞(CTCs),在原发肿瘤部位扩散并达到继发性器官(转移),这就是癌症死亡的主要原因。因此,癌症的快速便捷检测对于研制诊断并治疗的个性化()癌症药物为重要。
    局部癌症可以通过组织病理学检测到可疑组织,但这项技术因为每个人的视敏度和经历不同而受到限制。另一方面,据报道,非粘连的异常CTCs可以根据肿瘤抗原和生物物理畸形被检测出。CTC的蛋白质标记如细胞角蛋白-8, -18和-19,CD44和上皮细胞粘附分子(EpCAM)是经常被发现的。迄今为止,基于对CKs+、CD45−和核+免疫染色的CellSearch,是目前经美国食品和药物管理局批准的可用于CTC检测的系统。自CTC标记会随肿瘤异质性、动态蛋白质周转,以及上皮-间叶细胞转换而变化的报道出现后,基于免疫学的检测方法就不是太可靠了。
    捕捉、离析和富集非粘连的异常CTCs,主要基于他们血液细胞大小和生物物理畸形的差异,比如形状、硬度和电化率。一些研究报道,肿瘤细胞的大小要大于血液细胞,这种差异主要归因于基于大小离析的原则,使用筛分和离析对上皮肿瘤细胞的大小的分析。在zui近的研究中,CellSearch证实了CTC (EpCAM+,CK +,DNA+,CD45−)粒度为10.7μm(前列腺癌),11μm(结肠癌),13.1μm(转移性乳腺癌)。而与此相反,据报道,白细胞的大小也可能与CTCs在同一范围内,因此基于大小的富集在识别目标细胞方面是有限制的。与正常细胞同行/血液细胞相对比,肿瘤细胞有更高的核质比,可变尺寸,异常核DNA等。CTC的细胞形态畸形使得大肠癌、前列腺癌和转移性乳腺癌的临床疗效不佳。为了克服基于尺寸的富集方法缺陷,需要运用其他方法来增加CTC的检测/捕获效率。
    在本研究中,我们结合了两种方法从血液/正常细胞中区分癌细胞:1)根据粒度粒形来检测癌细胞;2)根据细胞形态畸形(表面轮廓)来识别癌细胞。换言之,使用Occhio 公司的FC200 粒径分析仪,可以对各种粒形参数的细胞进行测量。为了对细胞进行物理表征,我们假设将细胞悬液引入流动池中,配备高分辨率的CCD照相机,使用频闪照明来捕捉图像。通过内部的PIA-Pro粒子图像分析软件,可以自动分析捕捉到的图像其粒度粒形参数。利用上述注射流动粒子图像分析仪,我们先确定了粒度粒形参数的适当组合,可以区分各种癌细胞(已建立的癌细胞系)与正常细胞(红细胞、白细胞、脾细胞和淋巴结细胞)。挑选出用于分析的圆度(形状参数)和内径(尺寸参数)参数,实验证实,大多数癌症细胞的内径比正常细胞高出10μm以上。此外,电脑软件程序“癌细胞发现者”的设计是为了基于表面灰度(亮度/暗度)的不同从白细胞(内径≥10μm)中区分癌细胞。该软件在多种已建立的癌细胞系和小鼠源性淋巴结细胞、脾细胞上进行了验证。此外,还对诊断为癌症的猫和狗的血液样本中CTC-和团簇样颗粒进行了检测,并且评估了使用粒径分析仪测量细胞活力、生长和CTC标记的效果。
    结果与讨论
    使用比利时Occhio公司的FC200对细胞进行粒度粒形的综合表征。Occhio粒度粒型分析仪(FC200)由1)进样喷嘴2)注射泵3)配备高清CCD摄像头的流场单元4)和内置颗粒图像分析软件组成。FC200是湿法分散粒子图像分析仪,可以分析空间分离的悬浮细胞。将分散在液体中的细胞(推荐的细胞浓度约为    2000cells/mL)通过射流喷嘴引入流动池中,用CCD相机通过频闪照明获得流经流动池的样本图像。进行图像分析时需要设置一个阈值以进行背景校正,然后利用粒子图像分析软件PIA-Pro对获得的图像提取并计算每个粒子的形态参数,该软件以多种用户可选择的格式呈现。与特征形状参数相关的信息,如ISO固体度(ISO:标准化组织)、凸度、亮度、亮度RSD (RSD:粒子的相对标准偏差)、ISO圆度、伸长率、ISO长宽比、ISO球形度,以及粒径参数,如ISO内径、ISO面积直径、平均直径、宽度、长度和ISOzui大距离,均可以通过图像以单个粒子的形式进行直观验证。
    在这个工作中,SP2/O骨髓瘤细胞被选作个示例,原因是我们之前实验的结果表明,SP2/O细胞的平均内径是11.5μm,要高于老鼠红细胞(平均4.4μm)。我们先通过粒径分析仪观察SP2/O细胞在不同稀释速率下注入小鼠血液的结果(图1 a–f)。从得到的图像清楚地显示,随着加入血液中SP2/O细胞比例的增加,较大细胞(SP2/O细胞)的数量也随之增加,这也证实了粒径分析仪来检测血液中癌细胞是可行的。此外,可以直观的看到血液细胞的粒径分布和SP2/O细胞计数(横坐标:直径μm,纵坐标:number %,Fig.1g and by volume),以及体积参数(横坐标:直径μm,纵坐标:volume %,Fig.1h),这表明在癌细胞检测中,以体积表征粒径分布要优于以数量表征,因为SP2/O癌细胞的半径大于血液细胞。
    为了检测血液中SP2/O细胞的混合物,对各种大小和形状的组合进行了测试。图2显示一个典型的SP2/O细胞(1×106 /毫升)分散在小鼠血液(血液中的细胞悬液用磷酸缓冲盐(PBS)稀释51倍,其中含5.1×109 /毫升红细胞(RBC)和ca. 2×104 SP2/O cells/mL) 中的二维散点图,该散点图主要基于粒径大小和粒形参数(散点图中的每个点对应于一个细胞(颗粒),Fig. S1b)。例如,Figs. 2a–d是SP2/O细胞加入到老鼠血液中,按按体积计的散点图,纵坐标为圆度(%),横坐标为平均粒径(μm) (Fig. 2a),凸度(%)(Fig. 2b),亮度(%)(Fig. 2c),和zui大距离(μm) (Fig. 2d)。Figures 2e–g显示分布在血液中的SP2/O细胞,按体积计的散点图,横坐标为内径(μm),对应的纵坐标分别为区域直径(μm)(Fig. 2e),球形度(%)(Fig.2f)和圆度(%)(Fig. 2g)。
    另外,Figs. 2h-i显示按体积计,小鼠血液(1000×在PBS稀释)和SP2/O细胞(2×103 /毫升的PBS)的分布,分别用内径(μm) (x轴)和圆度(%)(y轴)来表征。血细胞的散点图证实,几乎所有血液细胞位于散点图的左边象限,其内径小于10μm,而SP2/O细胞主要位于右边象限,内径大于10μm。这些结果表明,内径和圆度是检测小鼠血液中SP2/O细胞癌变的zui佳组合。
    根据上述结果,11种粘连和非粘连癌细胞—LLC, B16, K562, HeLa, A549,Colon-26, Jurkat, Molt-4, MDA-MB-468, MDA-MB-157 and MC38,可以使用粒度分析仪,以散点图的形式展示,同时测量内径和圆度来进行检测辨别(Figs.3 a–k)。这表明,所有这些癌症细胞系的内径均大于10μm)。此外,用粒径分析仪获得了癌细胞系中zui大的5个单体细胞的图像,用圆度(circ)和zui大直径(Dimax)表征。结果表明,与其他基于尺寸的检测系统相比,粒径分析仪获得的细胞图像在识别单个细胞/簇/碎片方面具有更显著的。
    为比较正常血细胞和癌细胞系,对正常的小鼠(C57BL/6)血液、脾脏和淋巴结细胞的粒径和粒形参数进行了检测。全部血细胞经密度梯度离心分离成血小板、外周血单核细胞(PBMCs)和红细胞,用粒度分析仪进行分析。同时,对红细胞缺失的脾细胞和淋巴结细胞进行分析,以确定白细胞的大小。正常细胞如红细胞、血小板、白细胞(WBCs)、淋巴结细胞和脾细胞的散点图(圆度与内径)分别如图3 l-p所示。此外,zui大的5个单体细胞的正常细胞的图像如图所示。癌细胞和正常细胞的粒径分布曲线分别如图所示。从粒度分析仪获得的散点图和粒径分布曲线清楚地显示了正常细胞和癌细胞之间的粒径差异,也证实了“内径”和“圆度”是深入区分血细胞(内径< 10μm)和癌症细胞zui合适的参数。
    据报道,一些白细胞的大小与癌细胞大小相近。在我们的研究中,我们观察到777个WBC颗粒(内部直径4-50μm)中会有一个内径为10.3μm的白细胞(图3)。这个信息促使我们开发一种新的计算机软件项目,从癌细胞的粒径分析图像中识别出白细胞(内径>10.3μm)。癌细胞的畸形与正常细胞相比对是众所周知的,一些报道也将癌细胞的畸形与他们的转移特性相关联。如图5所示,癌细胞系(SP2/O细胞和LLC细胞)与正常细胞(WBC和淋巴结细胞)的表面变形(粗糙度)的差异,成为了我们建立识别肿瘤细胞与正常细胞新的鉴别方法的基础。在图5a-b中,WBC和淋巴结细胞清晰地显示,中心的亮区和边缘较暗的区域以及较光滑的表面,而SP2/O和LLC的曲线显示却较为复杂(图5c, d)。这种差异可能是由于癌细胞内的DNA含量异常增高,影响了粒度分析仪在图像获取过程中细胞的亮度。
    粒度分析仪相机的分辨率(像素密度)是0.185μm/像素,zui大外径用下面的公式计算:外径(μm) =zui大水平像素×0.185。WBC、淋巴结细胞、SP2/O和LLC的外径分别是13.1μm(内径10.3μm),9.4μm(内径6.6μm),19.8μm(内径14.3μm)和26.1μm(内径23.0μm)。
    正常细胞、白细胞和淋巴结细胞的总驻点小于10个,而LLC和SP2/O癌细胞的驻点大于10(图5o, p)。“CCF ver. 1.0”检测正常细胞如白细胞和淋巴结细胞的准确率分别是83%和,对于癌细胞如SP2/O细胞和LLC细胞的准确率达到95%和,如表1所示。同样地,我们分析了各种其他癌细胞并评估它们的驻点,结果如表1所示。根据这些结果,我们可以得出,相比于来自WBCs的淋巴瘤/白血病细胞,“CCF ver. 1.0”可能在鉴别局部癌源性CTCs更有利。
    粒度分析仪对细胞的再培养
    为检验粒径分析仪对再培养的活性癌细胞,LLC, MDA-MB-157和MDA-MB-468细胞(24小时)的粒度分析效果。如图S7所示,经过粒径分析仪处理后,癌变细胞保留了其粘附特性。在经过粒度分析检测前后的染料排斥试验的结果表明,LLC和MDAMB-157细胞对粒径分析仪更敏感,而其他细胞Jurkat、Molt-4和MDA-MB-468不敏感。
    此外,还通过与WST法比较,检验了该方法对B16, LLC, MDA-MB-468, MDA-MB-157和Jurkat cells细胞增殖的检测效果。在粒度分析仪测量后,细胞受到24 ~ 45小时增殖作用评估。数据表明,在LLC、Jurkat和MDA-MB-468细胞间的增值有显著差异,而抑制细胞B16 and MDA-MB-157没有明显差异。
    我们还验证了粒径分析仪对CTC标志物(CD44和EpCAM)的分析效果。运用CD44和EpCAM免疫印迹法,对粒度分析仪分析在试管中培养了7天的MDA-MB-468细胞、经粒度分析仪处理的CTC标记物和抑制细胞样品进行了验证。在粒度分析仪测量前后,MDA-MB-468细胞中的CTC标志物(CD44, p=0.975和EpCAM, p=0.871)没有显著性的差异,这至少表明粒径分析仪对癌细胞的处理对癌细胞的CTC特性的影响可忽略不计。
    血液中癌细胞和肿瘤簇的检测
    在显微镜下可以清楚的实现用LLC-增强绿色荧光蛋白检测癌细胞。用粒径分析仪观察LLC细胞(1×107/mL) 0.9%盐水(图6a)和血液(红细胞数约0.7-1.3×1010/mL)混合物( LLC细胞浓度:稀释后8×104/mL(126×)0.9%生理盐水) (图6b)。典型的事例如图6c,显示了LLC-EGFP加入血液中的散点图。内部观察到,直径大于10μm的单个细胞通过“CCF ver.1.0”软件,依据表面粗糙度/亮度(Figs. 6d, 6e)将其分类为癌症细胞或非癌症细胞,如图5所示。“CCF ver. 1.0”的分析数据证实,10个细胞中有8个超过11 IFP值,因此被认为是癌细胞(图6e中“*”所示)。在粒度分析仪拍摄的166张照片中(血液中加入LLC细胞),血液中的1.1×1010 RBC/mL和1.6×107 LLC cells/mL被检出,数据近似于它们在标准样品中的数值。
    Aceto等报道CTC簇比起单个CTCs,具有更大的转移潜能和对细胞凋亡更强的的抵抗力,表明CTC集群与临床中的肿瘤转移尤为相关。为检验该方法对肿瘤细胞簇的检测效果,我们在试管中培养了癌细胞系肿瘤球肿瘤球。B16和lc - egfp细胞是在0.6%的甲基纤维素和DMEM培养基中培养5-6 天,然后用粒度分析仪进行分析(肿瘤簇图像如图S11所示)。LLC和B16细胞簇的散点图(盐水中)证实了簇也可以用粒度分析仪检测,其内径大于10μm(Figs. 6f, h)。此外,癌症细胞丛簇的检测也已经开展。LLC-EGFP和B16丛簇慢慢的注入C57BL/6小鼠血液中,然后用PBS稀释,zui后用粒度分析仪进行分析。如图6h和图6i所示,丛簇均位于散射图的右象限,内径大于10μm。数据表明,癌细胞群也可以在粒度分析仪上检测出。
    接下来为了检验粒径分析仪分析对丛簇分析的准确性,我们将LLC-EGFP和B16通过10μm尼龙网进行了过滤,然后用粒径分析仪对过滤前后的丛簇数量的变化进行了评估。图S12a-1和S12b-1为过滤前的LLC和B16丛簇散点图(x轴:内径,y轴:圆度),图S12a-2和S12b-2为过滤后散点图。表S12a-3和S12b-3显示了通过10μm尼龙网过滤后减少的颗粒总数和忽略不计的丛簇(>10μm),这意味着粒径分析仪在进行测量中,丛簇和较大颗粒被过滤掉,而对于小颗粒完全没有影响。图S13为zui大的10个分散颗粒在过滤前后的结果,同样证实了上述结果。
    接下来,我们在小鼠模型中验证了识别癌细胞的方法,在小鼠模型中注射B16细胞,因为B16癌细胞具有高转移性,用“CCF ver. 1.0”软件对它的的检测概率高达98%(表1)。取自肿瘤小鼠的血液和脾细胞(接种B16癌细胞13天)先通过流式细胞仪检测B16-EGFP癌细胞是否存在(图S14)。因为相较肿瘤小鼠血液中,用流式细胞仪比用粒径分析仪,可以在脾细胞中检测到更多的肿瘤细胞(图7)。正常小鼠和B16肿瘤小鼠的脾细胞散点图如图7a和图7b所示。图7c中的1-8(正常脾细胞)内径>10μm经“CCF ver. 1.0.”分析后证实他们的驻点均<10(图7e)。在肿瘤小鼠样本中,如图7d,12个细胞(No.9-20)中有5个细胞(No.9-13)被识别为癌细胞,其余为正常细胞细胞(No.14-20号),可能是脾细胞或活性白细胞(图7f)。No. 9-13细胞的特征与体外培养的B16细胞(图7d、7f,21C-24C)非常相似。
    我们不否认淋巴细胞会在细胞因子的刺激下被放大的可能性,但基于之前的数据,我们相信使用我们的软件“CCF”是可以证实较大的淋巴细胞是正常细胞。
    被诊断为癌症的猫狗血中CTC簇状颗粒的检测
    要在临床应用中检测癌症患者的全血中的CTC丛簇,需要从正常和诊断为癌症的猫和狗身上采集血样,用上述的粒度分析仪方法进行检测。如图8a和8e所示,正常的狗(样本ID:图0001- d)和猫(样本号:图0003- c)的血液散点图(y轴:圆度(%),x 轴:内径(μm))的颗粒(细胞/丛簇)大于10μm。另一方面,粒度分析仪检测到在肉瘤犬(样本编号:TU-0002-D)(图8b)血液样本中有2个较大的类颗粒肿瘤丛簇,在一只被诊断患有乳腺疾病的猫(样本编号:TU-0004-C)血液样本中发现了一个丛簇。通过对细胞进行“CCF ver.1.0”内径分析,将前十个单个细胞分类为癌症/非癌症细胞细胞(Figs. 8c, d)。这些数据证实了在犬血样本(样本号:TU-0002-D)中,2个内径> 10μm(编号1,2)的细胞中有一个细胞(>10驻点)细胞是癌细胞,其他有内径的细胞< 10μm被判定为正常细胞。对于猫的血液样本(图8e, f),一个CTC类丛簇颗粒同样被判断为癌细胞,而内径的< 10μm的细胞被判断为正常细胞(图8g, h)。更多临床资料见表S4。这些数据可以得出的结论是,粒度分析仪结合“CCF ver. 1.0”软件,能够检测出携带癌症的动物血液样本中的CTC类簇颗粒。
    正常人体血液中的癌细胞的检测
    我们对人类血液中的人肺腺癌A549细胞进行了测量。通过粒度分析仪测量人全血(生理盐水稀释)细胞中的A549细胞(图9a),其中只有少量大尺寸的正常细胞(内径>10μm)被观察到。大细胞的血液样本散点(内径= 10.2μm),“CCF ver. 1.0”软件对前7个大细胞的分析表明,它们的SPs <10(图9c),说明这些是正常细胞。接下来,用粒度分析仪(n=6)和“CCF ver. 1.0.”测量从人类血液中分离的白细胞,如图9e和图9f所示,挑选自图9d的8个细胞均被判断为正常细胞(SPs <10),尽管其中一些细胞的内径> 10μm。
    我们分析了人类A549癌细胞,其中zui大的8个细胞被确认为癌细胞。我们接着分析了相同浓度的人类白细胞和A549细胞的混合物。在实验中,内径为6.8 -25μm 的10个细胞中1-5号细胞被判定为癌细胞。正常的血细胞和A549细胞进行粒度分析仪测定结果如图S16所示。
    这些结果促使我们尝试用粒径分析仪检测人全血(6.3×106正常细胞) (稀释)中的A549细胞(1×105)。如图9m和9n所示,8个细胞中第1-5号细胞被判断为癌细胞。此外,粒度分析仪检测癌细胞的能力,在检测存在和不存在大细胞(A549细胞)的血液分析中得以被验证。浓度与被分析盐水中的细胞浓度相同(图S15c)。血液样品(n=11)中的A549细胞总数(内径> 10μm)为6.5±1.0×104大细胞/3.2×106血细胞。相比之下,生理盐水中A549细胞的数量为6.0±2.0×104 A549细胞/mL,几乎与之前血液中的数值相同,这表明在不大量失血的条件下,可以在人体中检测到癌细胞。
    zui后,我们检测了人类脐静脉内皮细胞(HUVEC)的形貌,这是一种正常的血管内皮细胞。HUVEC 内径为4-50μm,一些具有独特的形状和不同的圆度的大型细胞意外的被“CCF ver.1.0”判定为癌细胞(图S17b, c)。这一发现的原因尚不清楚,但可能与用来收集分离HUVEC黏附物的方法(胰蛋白酶化)有关。需要的详细研究需要对正常的细胞粘连进行分析。
    在这项研究中,我们使用了occhio粒形分析仪FC200对癌细胞和肿瘤团簇进行粒径和基于粒径的检测分析。使用粒度分析仪比以往的方法更加简便。它可以在短时间内(约5分钟分析1毫升样本)对颗粒/细胞进行表征。用户可选择多种格式显示自动分析数据,如粒径、粒形分布曲线和计数。碎片,单个细胞或团簇的散点图可以通过单独颗粒的图像显示,从而排除了产生无效数据的可能性。测试样品不需要预处理(例如细胞固定),并可使用任何一种稀释剂。与免疫学检测相比,该方法不需要固定细胞,反而允许目标细胞可以在体外进行检测和深入表征。
    值得注意的是,该方法对CTC检测限(灵敏度)的定义与之前的方法不同,换言之,该方法的检测限取决于分析血样的体积和粒径分析仪获得的图像数量,因此,它取决于计算机的内存和处理速度(内存越大,处理速度越快,灵敏度越高)。在我们目前的实验中(研究中使用的粒度分析仪),检测限约为每毫升血液中2000 CTCs/mL (可能含有1.1×106个红细胞)。
    因为在这些细胞峰值实验中使用的癌细胞数量比那些实际临床样本高,所以CTC的检测线需要进一步提高。
    根据细胞表面的亮度(暗度)曲线来识别正常细胞中的肿瘤细胞,使用“CCF ver. 1.0”软件程序是非常简便的。该方法适用于鉴别白细胞和脾细胞粘连的癌细胞,因此可以适用于医院、医疗设备和实验室,克服了对昂贵的CTC检测设备的需求。我们不否认抗癌药物、细胞激素如转化生长因子- beta (TGF-β)或其他因素会改变CTC和正常细胞的粒径粒形。所以就这些问题需要进行更深入的研究。总而言之,对于血液样品(诊断为癌症)的分析,使用粒度分析仪或其他更简单的设备与“CCF”辅助细胞识别软件相结合的方法,在临床应用中具有良好的前景,对癌症和相关疾病的诊断治疗具有重要的意义。








                                                               (本文内容来源于网络,如有侵权请联系删除)


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